Στην πιο μεγάλη της ακμή, κατά την αρχαιότητα, η Σάμος φτάνει τον 6ο π.Χ. αι. υπό την ηγεσία του τυράννου Πολυκράτη. Ο ιστορικός Ηρόδοτος την ονομάζει πολίων πασέων πρώτην ελληνίδων και βαρβάρων. Η ναυτιλία και το εμπόριό της γνωρίζει μεγάλη ανάπτυξη. Τα σαμιακά πλοία ταξιδεύουν σ’ Ανατολή και Δύση φέρνοντας στο νησί πλούτο και γνώσεις. Με τα πολεμικά της πλοία, τις σάμαινες, κυριαρχεί για μεγάλο χρονικό διάστημα στο Αιγαίο. Την οικονομική της ακμή ακολούθησε η αντίστοιχη πνευματική. Οι πιο μεγάλες μορφές στο χώρο του πνεύματος και της Τέχνης αναδείχτηκαν αυτόν τον αιώνα. Ο μαθηματικός και φιλόσοφος Πυθαγόρας, οι αρχιτέκτονες του Ηραίου και πρωτοπόροι της γλυπτικής Ροίκος και Θεόδωρος είναι οι πιο ονομαστοί. Προσελκύει καλλιτέχνες όπως ο Ίβυκος και ο Ανακρέων. Ιδρύει αποικίες στην κοντινή Έφεσο αλλά και στην Αμοργό, στη Σαμοθράκη και τη Θράκη, στη μακρινή Σικελία. Τέσσερα είναι τα πιο εντυπωσιακά έργα κατά τον αιώνα της ακμής στη Σάμο: Τα πολυκράτεια τείχη, το Ευπαλίνειον όρυγμα, το λιμάνι και το Ηραίον.
Τα πολυκράτεια τείχη, μήκους 6430 μέτρων προστάτευαν την αρχαία πόλη της Σάμου περικλείοντας μιαν έκταση 1,2 τετραγ. χιλιομέτρων. Ακόμα και σήμερα εντυπωσιάζεται ο επισκέπτης με τα ελάχιστα τμήματά τους που έχουν διασωθεί. Το ευπαλίνειο όρυγμα αποτελεί ένα κορυφαίο τεχνικό επίτευγμα μιας εποχής με λιγοστά μέσα και γνώσεις. Κατασκευάστηκε στα μέσα του 6ου αι. για την υδροδότηση της πόλης από τον μεγαρίτη αρχιτέκτονα Ευπαλίνο. Πρόκειται για μια σήραγγα μήκους 1036 μ. που διέσχιζε το βουνό και προκαλεί σήμερα το θαυμασμό για τη εξαιρετική ακρίβεια της διάνοιξης, δεδομενου ότι χρησιμοποιήθηκαν απλούστατα όργανα μέτρησης και τα εργαλεία της εποχής, σφυρί και καλέμι, για τον εκβραχισμό. Το υδραγωγείο αυτό λειτουργούσε μέχρι τον 7ο μ. Χ. αι., ύστερα καλύφθηκαν οι είσοδοί του και ανακαλύφθηκε πια το 1882 από τον ιερομόναχο της Αγ. Τριάδας Μυτιληνών Κύριλλο Μονίνα. Από τότε χρονολογούνται οι πρώτες εργασίες καθαρισμού του ορύγματος. Το ευπαλίνειο τελικά καθαρίσθηκε και μελετήθηκε από Γερμανούς αρχαιολόγους το 1971-1973.
Το τρίτο μεγάλο έργο της εποχής του Πολυκράτη ήταν το λιμάνι της πόλης με τους μώλους και τις αποβάθρες του. Το φυσικό λιμάνι μπροστά στην πόλη χωρίσθηκε με τους δυο λιμενοβραχίονες και άλλα λιμενικά έργα σε δύο: στο εξωτερικό που ήταν το εμπορικό και στο εσωτερικό που αποτελούσε το ναύσταθμο. Το πιο σπουδαίο λιμενικό έργο ήταν το “χώμα εν θαλάσση”, ένας μώλος μήκους 360 μ. πάνω στον οποίο θεμελιώθηκαν τα καινούρια έργα του λιμανιού του Πυθαγορείου. Όταν στη Σάμο ηγεμόνευε ο Γ. Κονεμένος (1851-1854) άρχισαν οι εργασίες διάνοιξης του λιμανιού, ενώ αργότερα ο ηγεμόνας Μιλτιάδης Αριστάρχης (1859-1865) κάλεσε τον μηχανικό Ούμαν ο οποίος έκαμε τις μελέτες για την κατασκευή του νέου λιμανιού του Τηγανίου, όπως ονομαζόταν τότε το Πυθαγόρειο.
Ο ναός της Ήρας, ο μεγαλύτερος απ’ όσους είχε δει ο Ηρόδοτος, βρισκόταν 5 χιλιόμετρα δυτικά της πόλης. Ένας δρόμος πλακόστρωτος, πλάτους 4 μέτρων, η Ιερά οδός, με αγάλματα και άλλα αφιερώματαστις δυο του πλευρές, συνέδεε την πόλη με το ιερό της Θεάς. Είχε μήκος 108,73 μ., πλάτος 54,8 και ύψος 25 μ. Ναός περίπτερος, δίπτερος, χτισμένος από τον αρχιτέκτονα Θεόδωρο, τον γυιο του Ροίκου, είχε 133 κίονες. Σήμερα σώζεται μόνον ένας και η περιοχή εξαιτίας του ονομάζεται, εκτός από Ηραίον, και Κολώνα. Κι άλλοι θεοί όμως λατρεύονταν στην αρχαία Σάμο και είχαν κτισθεί ιερά προς τιμήν τους, αλλά επισκιάζονταν από τη μεγαλοπρέπεια του Ηραίου. Λατρεύονταν ο Ποσειδώνας στο ακρωτήριο προς τον Επταστάδιο πορθμό, στο σημερινό Ποσειδώνιο, ο Διόνυσος, η Εργάνη Αθηνά, ο Απόλλων, η Αφροδίτη. Οι πιο μεγάλες γιορτές ήταν αφιερωμένες στην Ήρα. Εόρταζαν τη γέννηση της Θεάς και τους γάμους της με τον Δία. Τα Ηραία γιορτάζονταν με λαμπρότητα και μεγαλοπρεπή πομπή που ξεκινούσε από το Άστυ και, διά της Ιεράς Οδού, κατέληγε στο ναό της Ήρας. Μεγάλη επίσης γιορτή ήταν τα Τόναια, κατά την οποία αναπαριστανόταν το θαύμα που έκαμε η θεά, όταν Αργείτες έκλεψαν το ιερό ξόανό της για να το μεταφέρουν στο Άργος. Όσο κωπηλατούσαν, το πλοίο τους, αντί να ανοίγεται στο πέλαγος, επέστρεφε στη στεριά και κατάφερε να ξεφύγει από τον κίνδυνο, μόνον όταν οι απαγωγείς αποβίβασαν στην ακρογιαλιά της Σάμου το ξόανο.
Στο στενό της Μυκάλης, τη θάλασσα ανάμεσα στη Σάμο και τη Μικρά Ασία, το 479 π.Χ. παίχτηκε η τελευταία πράξη της μεγάλης σύγκρουσης Ελλήνων και Περσών. Οι Έλληνες νίκησαν τους Πέρσες σε ναυμαχία και πεζομαχία, θέτοντας τέλος στις προσπάθειές τους να επεκταθούν στη Δύση και να κυριαρχήσουν στη Μεσόγειο. Ύστερα από τους περσικούς πολέμους η Σάμος συμμετείχε με άλλες πόλεις-κράτη στη συμμαχία των Αθηναίων, από την οποία δεν κατόρθωσε να φύγει, ακόμα κι όταν η συμμαχία μεταβλήθηκε σε ηγεμονία. Η προσπάθεια των Σαμίων να ακολουθήσουν το δικό τους δρόμο συνάντησε τη δυναμική άρνηση των Αθηναίων, οι οποίοι με αρχηγό τον Περικλή, το 439 π.Χ., πολιόρκησαν και ύστερα από εννιά μήνες κατέκτησαν και κατέστρεψαν την πόλη. Από τότε η Σάμος προσδέθηκε στο άρμα της αθηναϊκής ηγεμονίας και παρέμεινε πιστή σύμμαχος της Αθήνας, παρακμάζοντας μαζί της.
